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RNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用
行業(yè)新聞 2018-11-13
　　細(xì)胞作為生命結(jié)構(gòu)的基本單位，儲存大量的生物信息。細(xì)胞異質(zhì)性是生物組織的普遍特征，即使是相同類型的細(xì)胞受到周圍微環(huán)境的影響也會存在基因表達(dá)的差異。細(xì)胞的發(fā)育是一個動態(tài)過程，處于不同階段的同一細(xì)胞基因表達(dá)不同。以往的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(bulk RNA-sequencing，bulk RNA-seq)[3]需要對成千乃至上百萬的細(xì)胞大樣本進(jìn)行分析，是對大量細(xì)胞測序分析得出的平均結(jié)果，或者反映的是數(shù)量占優(yōu)勢的細(xì)胞數(shù)據(jù)，這就會掩蓋部分重要信息，忽略細(xì)胞之間或細(xì)胞亞型之間的異質(zhì)性，不利于生物多樣性的理解和研究。而對于干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞這類稀有細(xì)胞則因樣本量較少，無法作出準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析。為了解單細(xì)胞異質(zhì)性，近年來興起的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(single-cell RNA-sequencing，sc RNA-seq)備受關(guān)注。

　　sc RNA-seq是從單個細(xì)胞水平獲得全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜，其原理是將分離的單個細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序。2009年，Tang等[4]首次將該技術(shù)應(yīng)用于單個小鼠的卵裂球的基因分析中，最終發(fā)現(xiàn)了芯片未檢測到的5200多個基因和1800個可變剪切點(diǎn)。單細(xì)胞測序文庫構(gòu)建流程主要包括單細(xì)胞提取、細(xì)胞裂解、mRNA 反轉(zhuǎn)錄、cDNA 擴(kuò)增及文庫構(gòu)建等。本文將對sc RNA-seq過程中的幾項基本技術(shù)特征進(jìn)行分析，并闡述該技術(shù)在眼科研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。1sc RNA-seq的基本技術(shù)特征

   1.1單細(xì)胞分離技術(shù)　

       目前，常用的單細(xì)胞分離技術(shù)主要包括顯微操作(micromanipulation)、激光捕獲顯微切割(laser-capture microdissection，LCM)、熒光激活細(xì)胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)和微流控技術(shù)(microfluidics)等。因各項技術(shù)的靈敏度和產(chǎn)出率不同，應(yīng)用范圍亦有所不同。顯微操作技術(shù)和LCM是依賴人工在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和顏色特征來挑取單個細(xì)胞的方法，常用于從培養(yǎng)的細(xì)胞系、早期的胚胎細(xì)胞和固定組織切片中提取單個細(xì)胞。這兩種方法要求操作者技術(shù)熟練，難度較大，耗時較長，產(chǎn)出率較低。FACS有20種不同的參數(shù)設(shè)置，可依據(jù)細(xì)胞大小和形態(tài)，或預(yù)先用熒光標(biāo)記的抗體識別細(xì)胞表面標(biāo)記物，通過流式細(xì)胞儀分選出目的細(xì)胞。FACS具有全自動和高通量的特點(diǎn)，但是該項技術(shù)需要細(xì)胞初始樣本量較大，對于一些稀有細(xì)胞群體并不適用。微流控技術(shù)是在微米級通道中分離、捕獲單個細(xì)胞，可以用于稀有細(xì)胞的篩選，該方法反應(yīng)體系小、樣本需求量小、節(jié)約試劑、減少污染，因此，微流控技術(shù)被認(rèn)為是目前單細(xì)胞分離最好方法。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用講解_RNA-seq

　　1.2　單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增及測序文庫的構(gòu)建　

       單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增是sc RNA-seq的關(guān)鍵步驟。根據(jù)合成第二條cDNA 鏈時使用的酶，可將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的cDNA 擴(kuò)增方法分為PCR 法(如mRNA-Seq、Smart-Seq、Smart-Seq2、STRT-Seq和SMA)、體外轉(zhuǎn)錄法(如CEL-Seq) 和Phi29 聚合酶法(如PMA)。近年來，芯片液滴法作為新一代的文庫構(gòu)建方法，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢。

　　Islam等[11]發(fā)明的CytoSeq技術(shù)是將細(xì)胞懸液加入微反應(yīng)孔中進(jìn)行基因分析，用于研究細(xì)胞表達(dá)的差異，檢測罕見細(xì)胞類型，該方法不受細(xì)胞體積的限制，可直接對不同大小和性狀的混合細(xì)胞群進(jìn)行研究。但該技術(shù)目前只能用于已知基因的研究，不能發(fā)現(xiàn)新基因。Drop-Seq[12]和inDrops[13]是將細(xì)胞懸液封裝在含有DNA啟動子條形碼的水凝膠球的液滴中，然后細(xì)胞溶解，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄過程，mRNA被條形碼標(biāo)記。可追蹤每個基因的細(xì)胞來源，顯著提高了測序通量并降低了測序成本。液滴微流控平臺可同時捕獲上千個單細(xì)胞，并對其轉(zhuǎn)錄組或基因組進(jìn)行測序，具有反應(yīng)試劑少、效率高等特點(diǎn)。目前，許多平臺已經(jīng)商業(yè)化，并向研究人員提供單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)。Illumina是一個大量平行短序列測序平臺[14]，可同時對8個樣本進(jìn)行分析，細(xì)胞通量大，測序效率高，但儀器設(shè)備昂貴。

        ChromiumTM Single Cell 3′Solution平臺是10x Genomics公司研發(fā)的一種直接的、低成本的測序方法，一次可封裝8個樣本，耗時約6 min，細(xì)胞捕獲效率近50%。利用一種新的簡易算法“Supernova”，每次計算僅需2 d時間，大大提升了檢測效率。目前已廣泛應(yīng)用于臨床多個領(lǐng)域。ICELL8(WaferGen Biosystems)是一種新的單細(xì)胞RNA測序系統(tǒng)，芯片含有5184個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔均填充有寡核苷酸編碼的poly-d(T)、獨(dú)特的條碼和單一分子識別符，可捕獲約1300個單個細(xì)胞。

         該系統(tǒng)具有一個多樣本納米級分配器 Multi-Sample Nano-Dispenser (MSND)，與顯微鏡連接，可在數(shù)分鐘內(nèi)對所有的反應(yīng)孔進(jìn)行觀察，大約可以有37%的反應(yīng)孔捕獲單個細(xì)胞，MSND可以僅向含有單個細(xì)胞的反應(yīng)孔中填加反應(yīng)物，很大程度上節(jié)省了時間和費(fèi)用。該系統(tǒng)可以從復(fù)雜樣本中分離單個細(xì)胞，是一個高效經(jīng)濟(jì)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法，能夠完成上千個細(xì)胞的表達(dá)譜分析，使得研究人員能夠?qū)?fù)雜的生物樣本細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行破譯，具有細(xì)胞重復(fù)率低、交叉污染少、純度高等特點(diǎn)。Fluidigm公司研發(fā)的C1 單細(xì)胞擴(kuò)增儀器[21]，可以在同一芯片上自動完成Smart-seq步驟，將單細(xì)胞分離、反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增，構(gòu)建cDNA文庫，即可進(jìn)行二代測序(next generation sequencing，NGS)或qPCR，顯著提高了測序效率，省時省力。但是這些方法需要特殊儀器，耗資巨大。

         而改良的Smart-seq2方法，可以同時對上百個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，不需要試劑盒或特殊的單細(xì)胞捕獲工具。Gardeux的研究團(tuán)隊等開發(fā)了一個針對sc RNA-seq數(shù)據(jù)的完整分析的網(wǎng)絡(luò)平臺，即自動化單細(xì)胞分析途徑(automated single-cell analysis pipeline，ASAP)，運(yùn)用這一平臺，科研人員不需要具備強(qiáng)大的計算機(jī)技術(shù)和知識儲備，僅使用各種常用的算法和工具來分析sc RNA-seq的數(shù)據(jù)。這為人們分析細(xì)胞多樣性和異質(zhì)性提供了有效的工具。Hu等在論文中描述了一種新的方法，即用機(jī)器學(xué)習(xí)算法[如support vector machine (SVM) 和random forest (RF)]分析sc RNA-seq數(shù)據(jù)。這是一種鑒別不同細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異的最佳方法，還可以擴(kuò)展并適用于其他單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序表達(dá)譜的研究，如高度異質(zhì)性腫瘤的進(jìn)展和治療。許多生物信息學(xué)工具是專門設(shè)計用于單細(xì)胞測序的數(shù)據(jù)分析，在干細(xì)胞領(lǐng)域被用來區(qū)分細(xì)胞類型及細(xì)胞亞型，確定標(biāo)記基因。Monocle是最近發(fā)明的一種針對sc RNA-seq數(shù)據(jù)的無監(jiān)督算法，通過對數(shù)據(jù)空間降維形成一個偽時間軌跡，對細(xì)胞發(fā)育和分化的進(jìn)程進(jìn)行時間序列重構(gòu)。這種序列重排揭示了關(guān)鍵調(diào)控因子表達(dá)的閘門式變化，發(fā)現(xiàn)新型的細(xì)胞分化的調(diào)控因子。這項研究表明，用Monocle進(jìn)行單細(xì)胞表達(dá)分析，揭示監(jiān)管分化的新調(diào)控作用。


RNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用
　　1.3　sc RNA-seq的應(yīng)用　細(xì)胞是生物體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，在其生長發(fā)育過程中，因細(xì)胞狀態(tài)、環(huán)境刺激因素和內(nèi)在程序的不同，轉(zhuǎn)錄組信息的變化呈多樣性表現(xiàn)，這種多樣性是構(gòu)成細(xì)胞異質(zhì)性的關(guān)鍵因素。

        sc RNA-seq能夠從單個細(xì)胞水平研究RNA的差異表達(dá)。自2009年，Tang等首次應(yīng)用sc RNA-seq以來，這項技術(shù)已發(fā)展成為研究復(fù)雜生物體系細(xì)胞異質(zhì)性的有效方法，被更多的研究人員應(yīng)用于多個研究領(lǐng)域，包括干細(xì)胞發(fā)育和分化、胚胎期器官的發(fā)育、腫瘤、免疫、神經(jīng)以及微生物等。
        下面將對近年來該技術(shù)在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

       2sc RNA-seq在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用

       2.1sc RNA-seq在眼部細(xì)胞亞型及罕見細(xì)胞類型鑒定中的應(yīng)用　

       神經(jīng)系統(tǒng)是由多種細(xì)胞組成，僅與視覺相關(guān)的成年小鼠大腦視皮層就含有上百萬個細(xì)胞。精確的細(xì)胞分類有助于科學(xué)家對大腦的發(fā)育、功能以及疾病狀態(tài)等方面進(jìn)行研究。近年來，根據(jù)sc RNA-seq在大腦皮層、下丘腦以及感覺神經(jīng)元等方面研究的應(yīng)用，將細(xì)胞按基因表達(dá)特征進(jìn)行分類，使人們對神經(jīng)多樣性的理解更加深入。

        視網(wǎng)膜屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，含有60余種神經(jīng)元，在視覺圖像產(chǎn)生過程中起特定的作用。視覺圖像的產(chǎn)生包括3個階段，首先平行光線被光感受器細(xì)胞捕獲，將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，然后?jīng)雙極細(xì)胞傳導(dǎo)至特定的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形成神經(jīng)沖動，最后經(jīng)視神經(jīng)傳入大腦視覺中樞。視網(wǎng)膜是一種易于觀察、易于獲取的組織，又具有一定的神經(jīng)元多樣性，是研究細(xì)胞發(fā)育、神經(jīng)元分化以及神經(jīng)系統(tǒng)多樣性的完美模型，它由多種細(xì)胞類型組成，包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、無長突細(xì)胞、雙極細(xì)胞、光感受器細(xì)胞以及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等。對于如此復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，應(yīng)用傳統(tǒng)的大量細(xì)胞基因測序(bulk RNA-seq)，將不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞之間的特異性。而sc RNA-seq則能夠精確反映單個視網(wǎng)膜細(xì)胞的基因表達(dá)情況。

         Goetz等在JoVE中闡述了單個視網(wǎng)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析的實驗步驟。Laboissonniere等應(yīng)用視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亞型進(jìn)行分類，目的是將細(xì)胞的基因表達(dá)特征與其功能和形態(tài)學(xué)特征聯(lián)系起來。為確保這種分類方法分離出的細(xì)胞亞型具有相同的功能，他們提出在細(xì)胞分離和測序之前先確認(rèn)它的形態(tài)和功能，使得細(xì)胞亞型標(biāo)記物的識別更容易，分類更準(zhǔn)確。Shekhar等用GFP轉(zhuǎn)染雙極細(xì)胞和Müller膠質(zhì)細(xì)胞，F(xiàn)ACS收集GFP陽性細(xì)胞，應(yīng)用大規(guī)模平行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(Drop-seq)對約25 000個小鼠視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞進(jìn)行分類，獲得了15個細(xì)胞亞型。同時利用分子表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)相匹配的方法驗證了這種分類方法的準(zhǔn)確性，并鑒定了數(shù)十種新的遺傳標(biāo)記物。單個視網(wǎng)膜亞型細(xì)胞遺傳標(biāo)記物的鑒定，有助于研究和繪制與特定視功能相關(guān)的靶點(diǎn)，使人們更深入地了解細(xì)胞功能及細(xì)胞異質(zhì)性的來源，探究維持細(xì)胞多樣性的基因網(wǎng)絡(luò)。

　　另外，sc RNA-seq可用于罕見細(xì)胞類型的鑒別，如干細(xì)胞、前體細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞等，以利于深入理解這些稀有細(xì)胞種群的生物學(xué)功能和特征。Kameishi等[40]發(fā)現(xiàn)兔角膜緣上皮旁群細(xì)胞與非旁群細(xì)胞相比具有干細(xì)胞樣表型，應(yīng)用GO(gene ontology)分析和RNA測序表明角膜緣上皮旁群細(xì)胞的間充質(zhì)/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)較上皮細(xì)胞標(biāo)記物顯著增強(qiáng)，另外，單細(xì)胞qRT-PCR顯示角膜緣上皮旁群細(xì)胞至少含有2種未成熟的細(xì)胞群，具有內(nèi)皮樣或間充質(zhì)樣表型，提示在角膜緣存在一種新型的角膜上皮干細(xì)胞，與傳統(tǒng)的角膜上皮干細(xì)胞不同。目前，角膜緣上皮旁群細(xì)胞的研究促進(jìn)了角膜上皮再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)展，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的分析不僅僅鑒定了新的角膜上皮干細(xì)胞，同時也可以更好地理解干細(xì)胞或前體細(xì)胞在體內(nèi)組織損傷修復(fù)過程中的作用。

　　2.2　sc RNA-seq對年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)病機(jī)制及治療的研究　視網(wǎng)膜退行性病變，如視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)，以光感受器細(xì)胞進(jìn)行性損傷為特征，是發(fā)達(dá)國家視力喪失的主要原因[41]。先前關(guān)于AMD的遺傳學(xué)研究認(rèn)為可能的危險因素包括基因遺傳、紫外線暴露、飲食習(xí)慣、心血管疾病、吸煙、飲酒等，其中基因遺傳因素起非常重要的作用[42]。隨著sc RNA-seq等基因組技術(shù)的研究進(jìn)展，科學(xué)家將基因與發(fā)病機(jī)制相聯(lián)系，進(jìn)一步明確該疾病的發(fā)病機(jī)制。

RNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用
 
       Radeke的研究團(tuán)隊對68例捐獻(xiàn)的眼組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序基因比較，其中包括31例正常眼，26例已確診為AMD，11例被認(rèn)為具有發(fā)展成為AMD的高危因素。研究發(fā)現(xiàn)50余個基因在AMD 細(xì)胞中高表達(dá)，其中前20個基因能夠?qū)MD的診斷進(jìn)行預(yù)測。在對RPE/脈絡(luò)膜層的轉(zhuǎn)錄因子檢測中，他們發(fā)現(xiàn)與凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在干性AMD患者中呈高表達(dá)，而與血管生成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在濕性AMD患者中呈高表達(dá)。另外，他們還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是所有類型AMD的核心特征，由此推斷AMD可能是一類具有共同的免疫反應(yīng)過程的單一疾病。根據(jù)這些結(jié)果，針對核心免疫過程的藥物可能成為AMD治療的靶向藥物。Morgan 等應(yīng)用基因組技術(shù)比較了健康者和AMD患者的外周血及眼組織中基因表達(dá)和信號通路的不同，確定了特定危險基因與該疾病的關(guān)系，為實現(xiàn)特異性的靶點(diǎn)治療提供科學(xué)依據(jù)。

　　2.3　sc RNA-seq對干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變后基因單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序變化的評估　視網(wǎng)膜退行性病變尚無有效的治療方法，干細(xì)胞或前體細(xì)胞移植是目前實驗研究中最具潛能的治療方法，可能終止或延緩視力喪失的進(jìn)程。隨著干細(xì)胞移植在視網(wǎng)膜退行性病變治療方面研究的不斷進(jìn)展，其基因表達(dá)變化的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。
               Jones 等將人腦源性神經(jīng)前體細(xì)胞(human neural progenitor cells，hNPC)移植到RCS (royal college of surgeons)視網(wǎng)膜退行性病變大鼠視網(wǎng)膜下，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得實驗組和對照組的視網(wǎng)膜中RNA數(shù)據(jù)，與假手術(shù)組RCS大鼠和 LE (long evans)大鼠對照。分析得出RCSsham 與LEsham有1215個基因差異性表達(dá)，RCShNPCs與 RCSsham 有283個基因差異性表達(dá)，比較這2組基因，發(fā)現(xiàn)68個逆表達(dá)基因(稱為救援基因)，包括Pdc、Rp1和 Cdc42ep5。該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序研究結(jié)果為研究hNPC移植治療視網(wǎng)膜退行性病變后的基因表達(dá)變化提供依據(jù)。在將來的干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變的研究中，sc RNA-seq可用于增強(qiáng)或預(yù)測治療的反應(yīng)。

　　2.4　sc RNA-seq在眼部腫瘤的靶向治療研究中的應(yīng)用。
        眾所周知，腫瘤的分子特征和細(xì)胞特征可提示腫瘤細(xì)胞的來源，為靶向治療提供依據(jù)。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種嬰幼兒常見的眼內(nèi)惡性腫瘤。1897年Wintersteiner曾嘗試將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的細(xì)胞特征與特異性的視網(wǎng)膜細(xì)胞類型聯(lián)系起來，認(rèn)為光感受器細(xì)胞可能是腫瘤細(xì)胞的來源。還有人則認(rèn)為其來源于前體細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞或無長突細(xì)胞。關(guān)于腫瘤細(xì)胞的來源問題引起的爭論大約持續(xù)了一個世紀(jì)。

        如今，Mcevoy等對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者及小鼠模型的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞基因表達(dá)陣列分析，顯示在單一視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的細(xì)胞中存在多種細(xì)胞類型特異性表達(dá)，主要包括光感受器細(xì)胞、視網(wǎng)膜前體細(xì)胞和含有無長突細(xì)胞與水平細(xì)胞的中間神經(jīng)元，這種現(xiàn)象在正常視網(wǎng)膜發(fā)育過程中是不存在的，說明在腫瘤的發(fā)生過程中，控制視網(wǎng)膜發(fā)育和構(gòu)建不同細(xì)胞類型的信號通路受到干擾。該研究指出從單細(xì)胞水平綜合分析腫瘤的分子、細(xì)胞及生理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和生物合成酶在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中表達(dá)，干擾這些通路可以減少腫瘤在體內(nèi)外的生長。靶向神經(jīng)遞質(zhì)兒茶酚胺和吲哚胺受體或下游成分在未來的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序研究中可能成為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤治療的新靶點(diǎn)。

RNA-seq單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在眼科領(lǐng)域中的研究應(yīng)用

　　2.5　sc RNA-seq在眼外傷引起的基因表達(dá)變化中的應(yīng)用　眼球爆炸傷在嚴(yán)重?fù)p壞視功能的同時還會發(fā)生基因的改變。Struebing等利用50 psi(1 psi=6.895 kPa)的高壓空氣波致54只小鼠眼球爆炸傷，5 d 后對視網(wǎng)膜RNA表達(dá)進(jìn)行分析，約40%基因表達(dá)發(fā)生變化。通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法，發(fā)現(xiàn)與天然免疫和獲得性免疫相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)活化，伴隨淋巴細(xì)胞入侵到視網(wǎng)膜內(nèi)層，爆炸損傷還會引起視功能和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的進(jìn)行性喪失。

       3總結(jié)與展望 隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，sc RNA-seq從技術(shù)和設(shè)備等多方面不斷優(yōu)化，涌現(xiàn)出一系列的商業(yè)化的測序平臺，具有單次樣本量大、耗時短、費(fèi)用低、通量高等特點(diǎn)。sc RNA-seq可以從單個細(xì)胞的分子水平獲得全基因組的表達(dá)譜，深入了解細(xì)胞個體間的差異，已廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞的分化、胚胎及器官的發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等多個研究領(lǐng)域，并取得長足的進(jìn)步。近年來，該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用也日漸增多。

        sc RNA-seq可鑒別眼部細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物，有助于發(fā)現(xiàn)新的罕見細(xì)胞類型及細(xì)胞亞型，深入了解細(xì)胞間的個體差異。應(yīng)用該技術(shù)分析AMD的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的生物靶點(diǎn)和標(biāo)記物，可能作為視網(wǎng)膜退行性疾病治療的新方法。比較干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜退行性病變前后的基因表達(dá)變化，可用于增強(qiáng)或預(yù)測治療的反應(yīng)。通過該技術(shù)發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)記物，可追溯視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞來源，闡述腫瘤的發(fā)病機(jī)制，揭示腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，為腫瘤的預(yù)后評估及個體化治療提供依據(jù)。sc RNA-seq與生物信息學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合，可為揭示細(xì)胞發(fā)育和分化過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供強(qiáng)有力的檢測方法。
         目前，sc RNA-seq在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用仍較局限，隨著該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，在未來數(shù)年中可能迅速擴(kuò)展到眼部相關(guān)疾病的研究中，如評估干細(xì)胞或前體細(xì)胞向眼組織的分化過程中的基因表達(dá)變化;探索干細(xì)胞眼內(nèi)移植引起免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制;研究各種眼部腫瘤的發(fā)病機(jī)制、個體化治療和預(yù)后的評估等。該技術(shù)將逐漸應(yīng)用于臨床，指導(dǎo)疾病診斷及治療。
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